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病毒研究新进展！首次人工合成活新冠病毒，可帮助提供病毒毒株
发布时间：2020-02-25作者：青鸾传媒来源：全网营销点击：
雷锋网消息，近日，瑞士科研团队在已知新冠病毒基因序列的基础上，通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。
据悉，该技术能高效合成新冠病毒，尤其在新爆发病毒尚未被成功分离出之前，可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株，且该替代方案更为高效、安全。
其论文成果“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”于 2020 年 2 月 21 日发表于 BioRxiv，尚未经同行审议。
利用反向遗传学构建新病毒，意义何在?
公开资料显示，该项研究的科研团队大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家，他们联合德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构共同完成了该科研成果。
研究团队认为，利用已知的病毒基因组序列，通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株的替代方法，还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征，从而争取时间对疫情爆发做出快速反应。
论文中提到，反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具，它能够改变了人类对病毒发病机制和疫苗开发的认识。
像冠状病毒基因组这一类大型的 RNA 病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中被克隆和操作，因此需要一种快速而强大的反向遗传学平台进行研究。
此次，瑞士研究团队报道了一个基于酵母的合成基因组学平台，用于多种 RNA 病毒的基因重建，包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科等。
【 图片来源：biorxiv 所有者：biorxiv 】
研究人员利用病毒分离物、克隆病毒 DNA、临床样本或合成 DNA 生成病毒亚基因组片段，然后使用转化偶联重组技术 (TAR)克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体(YAC)，从而在酿酒酵母中实现一步重组。而 T7-RNA 聚合酶则被用于产生病毒 RNA，进而可以产生活病毒。
研究团队首先在其他 RNA 病毒(如鼠肝炎病毒 MHV)中检验了这一平台的准确度，团队测试了鼠肝炎病毒 A59 株中含有绿色荧光蛋白(MHV GFP)的基因克隆能力，结果表明测试的克隆中正确组装了 MHV 基因组的 YAC 占 90%，这表明病毒在酵母中的组装效率很高。
也正是利用该平台，研究人员在拿到合成 DNA 片段后一周内，对新冠病毒进行了工程改造和复活。
值得一提的是，这是一项根据已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作，该成果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关，该研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情爆发后，根据已经公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。
如何对新型冠状病毒进行工程改造和复活?
【 图片来源：biorxiv 所有者：biorxiv 】
具体来看，研究团队将病毒基因组分成 12 个片段，大小在 0.5kbp-3.4kbp。同时，为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪，研究团队将合成新冠病毒设计成可以表达 GFP(绿色荧光蛋白)。
因此，研究团队又将片段 11 分成 3 个包含 GFP 序列的子片段，GFP 序列被插入 ORF7a(开放阅读框，ORF)中从而在总计有 14 个片段。
研究团队让试剂公司化学合成上述 14 个 DNA 片段，1 月 14 日下订单，2 月 4 日拿到其中的 12 个片段。片段 5 和 7 在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成。
不过，研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本(SARS-CoV-2/München1.1/2020/929)，他们决定利用 RT-PCR 扩增获得片段 5 和片段 7。
利用 TAR 克隆，研究人员获得了所有 6 种新冠病毒构建体正确组装的分子克隆。
随后，研究人员利用转化偶联重组技术(TAR)，用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列，将这些 DNA 序列拼到一起。
获得完整的病毒序列后，研究人员用 T7 RNA 聚合酶将这一 DNA 序列转录为病毒 RNA，将该 RNA 用电穿孔技术导入到 VeroE6(猴肾细胞)中，使得细胞被感染，培养这些细胞的上清液(含释放出的病毒颗粒)注入到别的培养基中，可以感染别的细胞。
基于此，瑞士研究团队宣布，他们能在获取病毒的合成 DNA 片段后仅一周的时间内，对最近流行的新冠病毒的化学合成克隆进行工程改造和复活。并且，其病毒的重组有很高的效率和准确度，通常情况下，超过 90% 的克隆是正确的。
值得注意的是，研究人员还指出，尽管此前在酵母中进行同源重组已被用于很多分子病毒的克隆，但这一研究在对通过这种方法快速生成大型 RNA 病毒的全长 cDNA 的可行性进行了全面评估，尤其是这种大型 RNA 病毒在大肠杆菌中无法被稳定克隆。
值得注意的是，除新冠病毒外，研究团队还报道了利用该技术合成构建 MHV(鼠肝炎病毒，一种冠状病毒)和 MERS-Cov 等，而 HCov-229E 和 Zika 病毒的构建仍在实验进行中。
雷锋网(公众号：雷锋网)注：文章内容源于 biorxiv，雷锋网编译。
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